PCR实验室为什么要隔离三区？

我们以前遇到过一些客户，他们说PCR实验总是假阳性的。显然，他们没有添加模板，但扩展了产品。如果这种现象经常发生，我们应该注意操作环境。如果你去百度搜索如果PCR假阳性怎么办，以下建议将有防止交叉污染的建议。有人说模板DNA是一种溶解在去离子水中的大分子。它怎么能无缘无故地来污染环境？小编会一一解释。

这里有一个气溶胶的概念。气溶胶是一种由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散系统，可在空气中停留至少几个小时。在PCR反应过程中，液体蒸发冷凝。PCR管中的空气部分形成了气溶胶，携带了大量的DNA扩展产品（请注意，1ng扩展产品中可作为模板的DNA片段数量超过1ng启动模板中可扩展DNA片段数量的数百万倍甚至更高。例如，人类基因组DNA有30亿个BP，需要扩展的单个复制基因片段为300个BP。1ng启动模板可作为模板DNA片段，仅占启动模板DNA总量的千万分之一）。如果在实验室打开含有PCR扩展产品的管盖，大量携带DNA扩展产品的气溶胶将涌出并扩散到空气中，从而污染环境。虽然DNA在整个空间环境中的含量很低，但理论上，只要有一个DNA片段可以作为模板，PCR扩展就可以成功，这就是为什么污染环境中的阴性对比也可以扩展带。

因此，专业PCR实验室如临床PCR实验室)通常需要四区隔离(或至少三区隔离)。

常见的三区是指：

1.试剂配制区：PCR反应系统配制区。

2.标本处理区：包括扩增模板的制备，即我们经常提取DNA的地方；

3.PCR扩增及产品分析区：PCR扩增区，也是凝胶电泳分析扩增产品的区域。

如果PCR扩增区域与产品分析区域再次分离，则为四区隔离。

四区隔离的主要目的是防止气溶胶在每个PCR区域之间的流动——较好的方法是简单地将每个区域与建筑隔开，这一定是较好的隔离措施，但操作当然是不现实的，因此有一种方法可以为不同区域设置正负压：

试剂准备区（一区）：在干净的区域，保持微正压，使外部空气无法进入隔离污染源。此外，阴性模板应在该区域加入PCR管并盖，严禁在该区域打开。存放带DNA模板的离心管；

DNA模板添加区(二区):保持微负压，确保内部空气不泄漏，避免阳性模板的气溶胶污染外部环境。

扩增及PCR产品分析区(三区):保持微负压，防止内部空气泄漏，避免扩增产品的气溶胶污染外部环境。

操作时遵循一区→二区→三区的单一方向，不能逆向进行。

对于用于科研的PCR实验室，如果不能满足三区隔离的严格要求，至少应实现两区隔离：即正压区和负压区。正压区实施一区功能，负压区实施二区功能。

忌讳、可怕的是在正压区实施三区功能。我们有一个用户，所有的实验室都是正压的——因为进入实验室的空气都被过滤掉了。他自信地认为他们的实验室超级干净，做PCR没有问题，但他们的实验室有严重的PCR产品污染问题——所有的阴性对比都是阳性的。因此，PCR实验室的清洁度是次要的，不同区域之间的空气是否相互循环是关键的。

如果有同学问，我们的实验室没有正负压的区别，或者全负压，全正压呢？那么我们的建议是:不要怕麻烦，找一个远离三区的实验室(一般来说，就是打开PCR扩增产品的盖子区，比如电泳区)作为PCRI区，可以省去后续更多的麻烦。

由于PCR三区隔离的目的是阻断气溶胶的交流，请注意以下细节，思考气溶胶来自哪里:

1.每个区域应配备专用液体移除器，不得交叉混合。我们的一位用户将电泳室的液体移除器添加到模板中，阴性对照扩大了明亮的条带。

2.各区域应配备专用移液器吸头，不得交叉混合。

3.如果条件允许，需要在PCRI区工作后更换实验服.一次性鞋套.帽子.手套。

4.PCRI区配备带滤芯吸头。

许多做PCR的学生会对PCR进行吸头灭菌，或者在超净台进行PCR操作。但在小编看来，这是完全没有必要的，因为做好PCR重要的是防止扩增产品的污染，而不是无菌操作！想象一下，如果高压灭菌，DNA不会降解太多。如果细菌DNA参与PCR扩展，DNA带可以扩展到活菌或细菌尸体。